【文献阅读】脊髓性肌萎缩症的治疗发展：肌肉萎缩症和神经退行性疾病的前景（二）

【文献阅读】脊髓性肌萎缩症的治疗发展：肌肉萎缩症和神经退行性疾病的前景（二）

上一次我们分享了“脊柱肌肉萎缩的治疗发展：肌肉萎缩和神经退行性疾病的前景”，今天我们将分享下半年 - 除SMA以外的其他神经退行性疾病和肌肉疾病中的寡核苷酸和基因疗法的应用。

大多数寡核苷酸疗法都集中在基因沉默，转录和剪接调节上。由于寡核苷酸通常通过碱基互补配对与靶分子相互作用，因此可以从靶基因的主要序列中提取基因特异性铅化合物，并且也可以修改以提高生物利用度并增加对核素的抗性。 ASO方法还可以靶向患者特异性的等位基因序列，例如单核苷酸多态性（SNP）或包含导致罕见疾病的扩展重复的突变转录本。尽管小分子药物在全身应用方面也具有优势，但它们通常需要广泛的毒理学分析和化学优化以减少靶向影响。

可以将ASO分为RNase H-ASO和无RNase H活性的立体座ASO。立体原核苷酸可能会干扰目标转录物中转录物RNA-RNA和RNA-蛋白的相互作用。在这些情况下，寡核苷酸“掩盖”了剪接信号，使其不可见，最终导致剪接事件的变化，例如保留SMN2的外显子7。接下来，让我们简要介绍ASO在SMA外的神经退行性疾病和肌肉疾病中的当前应用。

ASO治疗肌萎缩性侧索硬化症（ALS）

肌萎缩性侧硬化症是一种致命运动神经元疾病，主要发生在成年人中。 10％的ALS病例是家族性的（FALS），而其余病例被认为是“零星”（萨尔），没有明确的家族史。遗传分析发现了单基因形式的ALS的主要基因，但是突变如何影响相应基因的功能仍然不清楚。如果该突变导致功能丧失（LOF），则需要设计相关方法以重建此功能。功能增益（GOF）突变需要阻断/抑制基因及其产物的突变。突变基因表达的下调也通常会影响未受影响等位基因的表达。 ALS的大多数突变是主导的，并表明GOF机制（例如蛋白质聚集或蛋白质特性的改变）会影响基本的细胞过程。有证据表明，在一些导致ALS的基因突变中，GOF和LOF同时出现，例如内含子扩张。这种情况需要仅影响突变基因和转录本的策略。在这里，作者列出了ASO在SOD1和FUS中的应用程序。

SOD1：编码Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD1）的基因是导致伪造的最早突变。大多数SOD1突变（18.9％）对应于伪造，而1.2％与SALS病例相吻合，两者均占主导地位。大多数引起ALS的SOD1突变没有显示SOD1酶活性与ALS疾病严重程度之间的任何关联。在SOD1敲除小鼠中，SOD1功能的丧失不会引起运动轴突伸长或运动神经元变性，并且内源性小鼠SOD1的存在或不影响人类转基因小鼠的存活。最近的一项临床研究包括三个部分（A，B，C）来检查有效性，安全性和耐受性。给药导致抑制了大约36％的SOD1中SOD1在CSF中的作用，这对SOD1-ALS患者是安全的。但是，这是否足以长期抑制SOD1-ALS的毒性作用仍然是一个问题，但这种治疗方法可能会减慢疾病的进展。

：欧洲和美国（G4C2）六核苷酸重复放大的ALS和前颞痴呆（FTD）的最常见遗传原因，位于染色体9的开放式阅读框架72（）基因中。在健康的人中发现了多达25种G4C2的重复，而患有C9ALS/FTD的人有数百至数千重复的重复。放大由位于内含子1中的启动子区域组成，该区域还包含第二个转录本。降低相应第二转录的表达水平会导致此类患者的蛋白质水平降低，并且该内含子扩展区也通过非经典形式的蛋白质生物合成。有一种组合的治疗方法，可以使含有G4C2重复的RNA沉默，同时通过基因治疗增加表达，这已被提出针对患者。 ASO靶向含有六核苷酸G4C2重复序列的转录本的感官链，并在成年ALS患者的1期临床试验中对安全性和耐受性进行了测试。

FUS：FUS/TLS突变会导致罕见的fals和FTD。 4％的fals患者中存在FUS突变，而常染色体显性率不足1％的盐患者。 DNA-/RNA结合蛋白FUS主要位于生理条件下的细胞核中。 FUS参与了DNA修复，但它也参与了RNA代谢作为RNA结合蛋白的多个方面，包括转录调节，替代剪接，mRNA稳定性和生物合成。 FUS-ALS/FTD的发病机理是由FUS聚集和细胞质脱位引起的毒性GOF和LOF。由特定的FUS突变引起的AL可以用ASO治疗，三名FUS-ALS患者（个性化ASO）被给予一名FUS-ALS患者，该患者已经患有呼吸系统疾病，并在接受这种个性化ASO治疗后一年死亡。该结果表明，击倒野生型FU可能会带来不利的后果。

ALS的遗传变异

-2是由ATXN2基因编码的蛋白质，ATXN2基因中的聚谷氨酰胺片段的扩增会导致脊髓小脑共济失调2型（SCA2）。 SCA2的特征是小脑和下丘脑的神经元变性，导致共济失调，帕金森氏病和痴呆症。已经发现，这种CAG重复放大与ALS的高风险相关，并且通过ASO降低-2水平可以延长ALS患者的寿命并减少功能和行为缺陷。 2020年9月，开始对CAG扩增的ALS患者进行的一项研究，以评估-2 ASO的安全性，耐受性和药代动力学。

ASO治疗肌肉萎缩

肌肉营养不良（DMD）和贝克型肌肉营养不良（BMD），两种形式的X连锁肌肉萎缩均由基因突变引起。 DMD的发病率约为1：5000，而BMD感染的儿童的发生率为1：30,000。严重的DMD通常在4岁之前开始，感染的男孩失去了12岁左右的步行能力。由于心脏和呼吸道护理的进步，其平均寿命为20至30岁。与SMA不同，DMD具有广泛的突变，从点突变到缺失和小插入到大复制。 DMD基因是人类最大的基因之一，其中包含79个外显子和约240万个碱基对。肌营养不良蛋白的主要作用是将心脏中的肌动蛋白 - 细胞骨架和骨骼肌连接到细胞外基质，这是通过与肌动蛋白和大分子分子收缩蛋白糖蛋白复合蛋白（DPG）相互作用来实现的。肌钙蛋白调节肌肉纤维的正常功能，以及由收缩引起的损伤，坏死和炎症，DPG缺陷导致肌肉无力，功能性肌肉层被纤维素和脂肪结缔组织所取代。疾病的严重程度在很大程度上取决于截短的肌营养不良蛋白的残留功能，该功能来自突变基因。点突变的患者轻度，对蛋白质结构和功能几乎没有影响。在BMD患者中还发现了多个外显子编码区，导致高度截断的肌营养不良蛋白mRNA仅为8.8kb。这些发现也是设计特殊的迷你肌营养不良蛋白基因的基础，该基因可通过病毒载体用于基因治疗，该病毒载体只能携带有限的CDNA。

外显子跳

保留的开放式阅读框（ORF）旨在限制DMD患者胡说八道突变中肌营养不良蛋白损失的影响，并且可以通过ASO递送来实现。 ASO与抗肌营养蛋白转录本结合，诱导缺失/跳过某些外显子，从而恢复ORF，从而导致与BMD相似的较短ORF。 FDA基于外显子跳，批准了三个基于ASO的（外显子51），（外显子53）和（外显子53）。但是，ASO也有一些局限性。由于DMD患者在许多不同的外显子中具有变化，从而导致阅读帧中断，因此这种单个外显子治疗方法仅适用于DMD之一。已经提出了多种外观的跳跃来克服单诊断疗法的局限性。目的是靶向具有变异外显子的DMD患者，靶向具有外显子45-55的外显子变体热点的ASO，并有效地跳过这些外显子在肌肉细胞和不变DMD患者的小鼠模型中。但是，在混合用途中，靶向几个ASO的靶向较高，需要在临床试验中进行测试。如果该发现成功地应用于临床实践，则在超过65％的DMD患者中可能有用。

基因组编辑

使用-CAS9进行基因组编辑似乎是恢复肌营养不良蛋白基因ORF的一种有吸引力的方式。 -CAS9应用不需要重新注入，因为它靶向DNA而不是。这种方法还可以用于治疗DMD基因的某些外显子重复的患者，因为它可以去除其他外显子和其他基因插入。靶向变异外显子的多个指导RNA（GRNA）可以恢复培养的患者肌细胞中的抗体蛋白表达。当将这些心肌细胞植入小鼠中时，保持表达。由于CAS9通过GRNA靶向双链断裂（DSB），因此目标DNA的裂解仍然是一个问题，目前尚无使用基因组编辑方法来治疗DMD的临床试验。

基于AAV的基因疗法的前景超过SMA

在基于突变的LOF的情况下，相关治疗需要恢复基因功能。对于SMA，-SMN1的基因治疗表明，这种方法对于治疗神经退行性疾病是可行的。 1.1×/kg的特异剂量足以将基因转移到临床上相关的运动神经元中，并保持不良反应，例如低水平的严重急性肝损伤。一些学者认为，肝氨基转移酶的增加是对病毒颗粒反应的结果。但是，对于肌管肌病，含有肌管蛋白1的高剂量AAV8颗粒的系统递送是致命的。在接受2×/kg剂量的六名患者中，有2例死于进行性肝功能障碍和败血症。假定AAV会直接损害肝细胞。因此，一方面，AAV是有效的基因转移向量，另一方面，它们具有严重的炎症反应，尤其是在大剂量全身治疗中。可以通过调节免疫反应来克服此问题。通过将金属蛋白酶IDES或IDEZ与IgG一起使用，可以降低基因治疗对DMD等疾病的副作用。另一种方法是局部注射，它是将重组病毒注入鞘。在最近的一项研究中，两名ALS患者接受了含有SOD1靶向的单个鞘内输注。 SOD1转录本和蛋白质的下调是通过印迹的一名患者的脊柱解剖样品中的下调。同一患者的右腿强度有了短暂的提高，但没有变化的生活能力，而第二名患者在12个月的观察期间保持了稳定的寿命能力。因此，学者提出，鞘内注射AAV递送的可能对SOD1具有持续的有益作用，但可能需要免疫抑制。

基于AAV的微收缩蛋白（µDYS）基因转移

理想情况下，DMD的治疗应恢复骨骼肌中肌营养不良蛋白的表达。但是，肌营养不良蛋白基因太大，无法加载功能性AAV颗粒。当前的策略是绕过这种瓶颈，并使用截短的肌营养不良蛋白，其残留功能足以削弱疾病。目前正在进行的临床试验使用微肌营养素基因治疗，并初步结果表明，超过80％的肌肉肌营养不良蛋白是阳性的，并且在治疗后活检中μDys明显表达（与正常人相比，95.8％）。但是，微蛋白不包含全长肌营养不良蛋白的所有功能元素，它们与其他蛋白质相互作用以赋予肌动蛋白的能力。另一种选择是使用微型肌营养不良蛋白相关的蛋白（μUTRO），该蛋白与某些蛋白质蛋白相互作用中的肌营养不良蛋白不同，这可以防止肌肉病变，但是尚未确认对疾病表型的积极影响。第三种方法是B1,4-N-乙酰乳糖胺转移酶（）的过表达，该酶刺激了关键的细胞骨架结合蛋白的上调，该蛋白可以用作替代肌营养不良蛋白。该疗法在临床前模型中证明是安全的，目前正在进行I/IIA期试验以评估其在人类中的安全性。

AAV基因转移在帕金森氏病（PD）中的应用

帕金森氏病是一种长期退化性疾病，影响多种神经元系统，尤其是运动系统。它最常见的症状包括震颤，僵硬，运动缓慢和行走困难。随着疾病的发展，非运动症状（例如认知和行为变化）变得显而易见。运动症状是由黑质中多巴胺能神经元变性引起的，这导致丘脑的抑制作用增加。因此，帕金森的患者在运动启动方面存在缺陷。深脑刺激下丘脑核是一种有吸引力的方案，因为左旋多巴和其他药物治疗无法阻止该疾病的退化过程。因此，使用AAV载体的基因治疗似乎是治疗PD的一种选择，也可以与深脑刺激结合使用。 PD基因治疗的一种综合方法是保留未受影响的神经元细胞中多巴胺的产生，以便在功能上维持基底神经节的电路。因此，可以在MRI引导下进行植物内给药AAV2，AAV2，cDNA脱羧酶（VY-）编码芳族L-氨基酸。或者，根据MRI指导，将AAV2-GAD（谷氨酸脱羧酶）发送到STN，以改善该大脑结构中的局部GABA抑制和正确的病理多动症。 AAV2-GAD的第1阶段和2次试验已经完成，这些患者的运动症状得到了改善，但不如STN深脑刺激的症状。

儿童近端SMA是由丢失或突变的SMN1引起的遗传均质疾病，并由可变的SMN2副本调节。理想的模型是鉴定潜在的细胞缺陷并开发治疗方法来补偿缺乏SMN蛋白【文献阅读】脊髓性肌萎缩症的治疗发展：肌肉萎缩症和神经退行性疾病的前景（二），并通过广泛的研究引入了寡核苷酸和分子治疗方法来调节剪接。基于AAV的基因疗法已进入临床阶段，用于治疗神经退行性疾病。由于大多数SMA病例在生命的早期被诊断出来，并且治疗通常在诊断后立即开始，因此对AAV的免疫反应的问题要比在其一生中暴露于该病毒的老年患者较少。当前，正在开发其他神经退行性疾病的治疗策略，例如肌萎缩性侧面硬化症，帕金森氏症，阿尔茨海默氏症和肌肉萎缩。

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