腺相关病毒：细小病毒家族的依赖病毒，研究热点解析

腺相关病毒：细小病毒家族的依赖病毒，研究热点解析

今天开始我们先来介绍一下单链DNA病毒，今天介绍的病毒是腺相关病毒（Adeno Virus/AAV/Adeno），是上世纪六十年代发现的，和上世纪六十年代比AAV更早发现的细小病毒一样，小鼠病毒/MVM/1也是细小病毒研究的一个热点。

腺相关病毒 2 型 (AAV-2)

腺病毒和腺相关病毒简介（放大）

腺相关病毒 (AAV) 是一种小型病毒（直径 20 纳米），可感染人类和其他灵长类动物。它们属于细小病毒科，是一种复制缺陷型、无包膜病毒。

AAV 不会引起疾病，而且这种病毒只会引起非常轻微的免疫反应。AAV 的几种特殊能力使其成为创建基因治疗病毒载体和创建同源人类疾病模型的有吸引力的候选者。使用 AAV 的基因治疗载体可以感染分裂细胞和静止细胞，并持续处于染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中，尽管病毒携带的基因确实会整合到宿主基因组中，但整合对于某些应用来说可能很重要，但它也可能产生不良后果。最近使用 AAV 进行视网膜基因治疗的人体临床试验显示出了良好的前景。

历史

腺相关病毒 (AAV) 以前被认为是腺病毒制剂中的污染物，最初在匹兹堡和美国国立卫生研究院的鲍勃·罗实验室中被鉴定为细小病毒。随后对人类进行的血清学研究表明，AAV 本身不会引起任何疾病，尽管它存在于感染腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒的人身上。

基因治疗

优点和缺点

野生型 AAV 因其多种特性而引起了基因治疗研究人员的极大兴趣。其中最主要的是该病毒似乎缺乏致病性。它还可以感染非分裂细胞，并能够在人类 19 号染色体上的特定位点（称为 AAVS1）稳定地整合到宿主细胞基因组中。这一特性使其比逆转录病毒更具可预测性，逆转录病毒具有随机插入和诱变的风险，有时还会导致癌症。AAV 基因组最常整合到上述位点，而随机整合到基因组中的频率可以忽略不计。然而，AAV 作为基因治疗载体的发展通过从载体 DNA 中去除 rep 和 cap 消除了这种整合能力。所需基因与驱动基因转录的启动子一起插入到反向末端重复序列 (ITR) 之间，在单链载体 DNA 被宿主细胞 DNA 聚合酶复合物转化为双链 DNA 后，ITR 有助于在细胞核中形成串联体。基于 AAV 的基因治疗载体在宿主细胞核中形成游离串联体。在非分裂细胞中，这些串联体在宿主细胞的细胞周期中保持完整。在分裂细胞中，AAV DNA 会因细胞分裂而丢失，因为游离 DNA 不会与宿主细胞 DNA 一起复制。AAV DNA 随机整合到宿主基因组中是可检测到的，但发生频率较低。AAV 还具有低免疫原性，这似乎仅限于产生中和抗体，而不会诱导明显的细胞毒性反应。这一特性以及感染静止细胞的能力使它们作为人类基因治疗载体优于腺病毒。

使用腺相关病毒确实存在一些缺点。载体的克隆容量相对有限，大多数治疗基因需要完全替换病毒 4.8 kb 基因组。因此，大型基因不适合在标准 AAV 载体中使用。目前正在探索克服有限编码容量的选项。两个基因组的 AAV ITR 可以退火形成头尾串联体，几乎使载体的容量增加一倍，并且插入剪接位点允许从转录本中去除 ITR。

由于 AAV 在基因治疗方面的优势，研究人员创建了一种 AAV 变体，称为自互补腺相关病毒 (scAAV)。AAV 包装单链 DNA，必须等待其第二链合成，而 scAAV 包装两条彼此互补的较短链。通过避免第二链合成，scAAV 可以更快地表达，尽管 scAAV 只能编码 AAV 容量有限的一半。最近的报告表明，scAAV 载体比腺病毒载体更具免疫原性，可以诱导更强的细胞毒性 T 淋巴细胞活化。

野生型感染引起的体液免疫被认为是一种非常普遍的事件。相关的中​​和活性限制了最常用的血清型 AAV-2 在某些应用中的使用。因此，目前正在进行的大多数临床试验涉及将 AAV-2 输送到大脑，这是一个相对免疫功能正常的器官。在大脑中，AAV-2 具有很强的神经元特异性趋向性。

临床试验

截至目前，AAV载体已在全球开展超过117项临床试验，约占病毒载体基因治疗试验的5.6%，近期在莱伯氏先天性黑蒙、血友病、充血性心力衰竭、脊髓性肌萎缩、脂蛋白脂肪酶缺乏症、帕金森病等多个疾病的1期和2期临床试验中取得了令人欣喜的结果。

结构

AAV 基因组由正链或负链的单链脱氧核糖核酸 (ssDNA) 构成，长度约为 4.7 kbp。基因组包括 DNA 链两端的反向末端重复序列 (ITR)，以及两个开放阅读框 (ORF) - Rep 和 Cap。前者由四个重叠基因组成，编码 AAV 生命周期所需的 Rep 蛋白，后者包含衣壳蛋白的重叠核苷酸序列：VP1、VP2 和 VP3，它们相互作用形成二十面体对称衣壳。

反向末端重复序列 (ITR) 各含有 145 个碱基。它们之所以如此命名，是因为它们的对称性，这已被证明是有效扩增 AAV 基因组的必要条件。这些序列赋予它们这种特性的特征是它们能够形成发夹结构，这有助于所谓的自我启动，从而使第二条 DNA 链能够独立于酶合成。ITR 是将 AAV DNA 整合到宿主细胞基因组（人类 19 号染色体）并挽救它的必要条件，也是制备有效包裹并与完全组装的抗 DNA 水解酶结合的 AAV 颗粒的必要条件。

对于基因治疗，ITR 似乎是顺式治疗基因所需的唯一序列：结构蛋白 (Cap) 和包装蛋白 (Rep) 可以反式提供。根据这一假设，已建立了许多方法来有效生产含有报告基因或治疗基因的重组 AAV (rAAV) 载体。然而，也有报道称，ITR 并不是顺式有效复制和包衣所需的唯一元件。几个研究小组已经在 Rep 基因的编码序列中发现了一种称为顺式作用 Rep 依赖元件 (CARE) 的序列。当 CARE 以顺式存在时，它已被证明可以提高复制率和 DNA 包装信号。

在基因组的“左侧”有两个启动子，分别称为 p5 和 p19，从中可以产生两个不同长度的重叠 mRNA。每个启动子都包含一个可以剪接或不剪接的内含子。考虑到这些可能性，可以合成四种不同的 mRNA，从而合成四种具有重叠序列的 Rep 蛋白。它们的名称表示其大小（以千道尔顿 (kDa) 为单位）：Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40。Rep78 和 Rep68 可以以自噬方式特异性地结合由 ITR 形成的发夹，并在发夹内的特定区域（指定为末端解析位点）切割。它们还被证明对于 AAVS1 特异性整合至关重要。所有四种 Rep 蛋白都具有结合 ATP 的能力并具有解旋酶活性，这上调了来自 p40 启动子的转录，但下调了来自 p5 和 p19 启动子的转录。

基因组右侧编码了三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的重叠序列，它们从启动子p40开始。这些蛋白质的分子量分别为87、72和62kDa。AAV衣壳由VP1、VP2和VP3的混合物组成，总共60个单体，以1:1:10的比例排列成二十面体对称结构，估计大小为3.9MDa。科学家后来确定了VP3蛋白的晶体结构。

Cap 基因产生另一种非结构蛋白，称为组装激活蛋白 (AAP)。该蛋白由 ORF2 产生，对衣壳组装过程至关重要。迄今为止，该蛋白在组装过程中的确切功能及其结构尚未确定。

所有三个 VP 都由一个 mRNA 翻译而来。合成此 mRNA 后，剪接可以以两种不同的方式进行：可以切除较长或较短的内含子，从而产生两个 mRNA 池：一个 2.3 kb，一个 2.6 kb 长。在辅助病毒存在的情况下，较长的内含子是首选，因此 2.3 kb 长的 mRNA 代表所谓的“主要剪接”。在这种形式下，VP1 蛋白合成开始的第一个 AUG 密码子被切除，导致 VP1 蛋白合成总体水平下降。主要剪接中保留的第一个 AUG 密码子是 VP3 蛋白的起始密码子。然而，在同一开放阅读框中，该密码子的上游是 ACG 序列（编码苏氨酸），该序列被最佳 Kozak 元件包围，这导致 VP2 蛋白的合成水平下降。事实上，VP2蛋白是VP3蛋白加上一个N端残基；VP1蛋白是VP2蛋白加上一个N端残基。

由于倾向于剪接较大的内含子，并且主要剪接处 ACG 密码子的翻译起始信号要弱得多，因此体内合成的 AAV 结构蛋白的比例约为 1:1:10，与成熟病毒体的比例相同。VP1 蛋白 N 端的独特片段被证实具有磷脂酶 A2 (PLA2) 活性，这可能是 AAV 颗粒从晚期内体释放所必需的。据报道，VP2 和 VP3 对正确的病毒体组装至关重要。然而，最近 等人表明 VP2 对完整的病毒体形成和有效的感染性来说是可有可无的，并且还提出 VP2 可以容忍其 N 端的大型插入，而 VP1 不能，可能是因为 PLA2 结构域的存在。

腺相关病毒DNA复制过程

腺相关病毒DNA复制属于滚动叉复制（ ）。

AAV基因组是具有末端发夹结构的单链DNA。感染后，3'发夹作为宿主修复酶的引物，将病毒的ssDNA转化为dsDNA形式，以便进行转录和复制。

复制在细胞周期的 S 期处于活跃状态。它由一种名为 Rep 或 NS1 的病毒核酸内切酶启动，该酶在发夹和编码序列之间产生缺口。这会产生一个 3' 端来启动链置换复制并开始滚动发夹复制，并产生等量的 ssDNA+ 和 ssDNA-。

病毒分类

2013 年，国际病毒分类委员会确认了两种类型的 AAV：腺相关病毒血清型 A（AAV-1、AAV-2、AAV-3 和 AAV-4）和腺相关病毒血清型 B（AAV-5）。

直到 20 世纪 90 年代，几乎所有 AAV 生物学研究都是使用 AAV-2。然而，AAV 在人类和其他灵长类动物中已经非常普遍，并且已从各种组织样本中分离出几种血清型。在人类细胞中发现了 AAV-2、AAV-3、AAV-5 和 AAV-6，在非人类灵长类动物样本中发现了 AAV-1、AAV-4、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10 和 AAV-11。截至 2006 年，已描述了 11 种 AAV 血清型。AAV 衣壳蛋白含有 12 个高变表面区域，大多数变异发生在三重近端峰中，但细小病毒基因组通常在不同血清型之间呈现高度保守的复制和结构基因。所有已知的血清型都可以感染来自各种不同组织类型的细胞。组织特异性由衣壳血清型决定，对 AAV 载体进行假型化以改变其向性范围可能对于其在治疗中的应用很重要。

腺相关病毒型

腺相关病毒 2 型

目前，AAV-2 的使用最为广泛。AAV-2 对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞具有天然的趋向性。

已发现三种 AAV-2 细胞受体：硫酸肝素蛋白聚糖 (HSPG)、αVβ5 整合素和成纤维细胞生长因子受体 1 (FGFR-1)。前者充当主要受体，而后两者具有辅助受体活性，并允许 AAV 通过受体介导的内吞作用进入细胞。Qiu Handa 等人对这些发现提出了质疑。HSPG 充当主要受体，尽管其在细胞外基质中的丰富性可以清除 AAV 颗粒。

其他类型

尽管 AAV-2 是各种基于 AAV 的研究中最常见的血清型，但其他血清型已被证明可能作为基因传递载体更有效。例如，AAV-6 在感染气道上皮细胞方面表现更好，AAV-7 对小鼠骨骼肌细胞的转导率非常高（与 AAV-1 和 AAV-5 相似），AAV-8 在转导肝细胞方面表现良好，而 AAV-1 和 -5 在将基因传递到血管内皮细胞方面非常有效。在大脑中，大多数 AAV 血清型表现出神经元趋向性，而 AAV-5 也转导星形胶质细胞。AAV-6 是 AAV-1 和 AAV-2 的混合体，其免疫原性也低于 AAV-2。

血清型在结合的受体上有所不同。例如，AAV-4 和 AAV-5 的转导可被可溶性唾液酸（每种血清型的形式不同）抑制，而 AAV-5 已被证实可通过血小板衍生的生长因子受体进入细胞。

人造病毒

人们为设计和改进新的 AAV 变体以用于临床和研究目的付出了很多努力。这些修改包括针对特定组织的新趋向性和修改表面残基以逃避免疫系统的检测。除了选择针对特定细胞的重组 AAV (rAAV) 的特定菌株外，研究人员还探索了 AAV 假型化，即创建某些 AAV 菌株的杂交种以接近更精细的目标。杂交种是通过从一种菌株中提取衣壳并从另一种菌株中提取基因组来创建的。例如，涉及 AAV-2/5（一种与 AAV-2 的基因组和 AAV-5 的衣壳混合的杂交种）的研究能够比 AAV-2 在脑细胞中实现更高的准确度和范围。研究人员通过创建具有混合衣壳的菌株继续进行假型化。AAV-DJ 具有来自八种不同 AAV 菌株的混合衣壳；因此，它可以感染人体许多部位的不同细胞，而单一趋向有限的 AAV 菌株则无法做到这一点。设计和改进新 AAV 变体的其他努力包括病毒变体的祖先重建，以产生具有增强特性的新载体，用于临床应用和 AAV 生物学研究。

免疫学研究

AAV 尤其受到基因治疗师的关注，因为它在人体中诱导免疫反应的能力显然有限，而这一因素应该会对载体转导效率产生积极影响，同时降低任何免疫相关病理的风险。

人们认为 AAV 在疾病中没有已知作用。

先天

动物模型已描述了对 AAV 载体的先天免疫反应。静脉注射给小鼠会引发促炎细胞因子的短暂产生，中性粒细胞和其他白细胞会浸润肝脏，这些细胞似乎会隔离大部分注射的病毒颗粒。溶源性因子和细胞浸润的水平似乎会在六小时内恢复到基线水平。相比之下，更具攻击性的病毒会产生持续 24 小时或更长时间的先天反应。

体液

已知该病毒可在动物模型和人类中刺激强大的体液免疫，多达 80% 的个体被认为对 AAV-2 呈血清阳性。已知抗体具有中和作用，对于基因治疗应用，它们确实会影响通过某些给药途径的载体转导效率。除了持续的 AAV 特异性抗体水平外，B 细胞记忆在动物初免-加强研究和临床试验中都表现强劲。在血清阳性的人类中，循环的 AAV-2 IgG 抗体似乎主要由 IgG1 和 IgG2 亚类组成，几乎没有或没有 IgG3 或 IgG4。

细胞介导

细胞介导的病毒和载体反应尚未得到充分研究，在 2005 年之前，文献中对此基本不予重视。使用基于 AAV-2 的载体治疗血友病 B 的临床试验似乎表明，可能正在发生针对性破坏转导细胞。结合显示 CD8+ T 细胞可以在体外识别 AAV 衣壳元素的数据，似乎可能存在对 AAV 载体的细胞毒性 T 淋巴细胞反应。细胞毒性反应将 CD4+ 辅助 T 细胞与对 AAV 的反应联系起来，而来自人体研究的体外数据表明，该病毒确实可能诱导此类反应，包括 Th1 和 Th2 记忆反应。在 AAV 衣壳蛋白 VP1 中已鉴定出许多刺激 T 细胞的抗原决定簇，如果将病毒用作基因治疗的载体，这些抗原决定簇可能是衣壳修饰的有吸引力的靶标。

感染周期

从感染细胞到产生新的感染性颗粒，AAV 感染周期有几个步骤：

1. 附着在细胞膜上

2. 受体介导的内吞作用

3. 内体运输

4. 逃离晚期内体或溶酶体

5. 转位至细胞核

6.脱模

7. AAV 基因组双链 DNA 复制形式的形成

8. rep基因的表达

9. 基因组复制

10. cap 基因的表达及后代 ssDNA 颗粒的合成

11. 完整病毒颗粒的组装

12. 病毒从受感染的细胞中释放出来。

其中一些步骤在不同细胞类型中可能看起来不同，这在一定程度上导致了 AAV 的天然趋向性明确且非常有限。病毒复制在一种细胞类型中也可能有所不同，这取决于细胞当前所处的细胞周期阶段。

AAV 的特征是复制缺陷，因此无法在未受影响的细胞中繁殖。AAV 通过与辅助病毒共同感染细胞进行传播。第一个被描述为能够成功产生新 AAV 颗粒的辅助病毒是腺病毒，AAV 这个名字就是由此而来的。随后，人们发现腺病毒基因组中的选定蛋白质、其他病毒（例如疱疹病毒、牛痘病毒或乳头瘤病毒）或基因毒性剂（例如紫外线或羟基脲）可以促进 AAV 复制。根据辅助病毒的存在与否，AAV 的生命周期分别遵循溶解途径或溶原途径。如果存在辅助病毒，AAV 基因表达就会被激活，从而使病毒能够使用宿主细胞的聚合酶进行复制。当辅助病毒杀死宿主细胞时，会释放新的 AAV 病毒体。如果不存在辅助病毒，AAV 就会表现出溶原性。当 AAV 单独感染细胞时，其基因表达受到抑制（AAV 不会复制）并且其基因组被整合到宿主基因组中（整合到人类 19 号染色体中）。

在极少数情况下，AAV 可以在没有辅助病毒的情况下自行复制，但通常 AAV 无法自行复制并会杀死细胞。

等人发现了高效产生子代 AAV 颗粒所需的最小腺病毒基因组。这一发现为重组 AAV 提供了一种新的生产方法，该方法不需要腺病毒共同感染 AAV 生产细胞。在没有辅助病毒或基因毒性因素的情况下，AAV DNA 可以整合到宿主基因组中，也可以以游离形式存在。在前一种情况下，整合由 Rep78 和 Rep68 蛋白介导，并且需要整合区域两侧都有 ITR。在小鼠中，已观察到 AAV 基因组以游离形式（环状头尾构象）长期存在于静态组织（如骨骼肌）中。

下一期要介绍的病毒是第一种与人类疾病相关的细小病毒——细小病毒B19，敬请关注！